文峰聊CNS炎症小体激活所引起的癌症

众所周知，及时激活和解决先天免疫反应对于宿主防御、组织内稳态和肿瘤免疫监测至关重要。有一个关键的先天免疫途径依赖于炎症小体复合物，其在生理条件下为清除病原体所必需的条件，但它们的异常活化可能是有害的。今天给大家解读的就是年9月发表在cell上的一篇文章：《GermlineNLRP1MutationsCauseSkinInflammatoryandCancerSusceptibilitySyndromesviaInflammasomeActivation》，即NLRP1的胚系突变导致炎性小体的激活，从而引起皮肤炎症和癌症易感性综合症。这篇文章中作者为我们描述了皮肤疾病：多重自愈掌跖癌（MSPC）和家族性角化病青苔状癌（FKLC），这两种病可能大家都没有听说过，但是它们的发生均是与炎症小体的异常活化相关的。

一、首先，Figure1中作者给我们介绍了四个患病家族的系谱图以及临床特征，斜线为死亡，黑色为患者。二、于是作者开始寻找MSPC和FKLC患者是否与基因突变相关呢？通过Figure2可看到作者发现了NLRP1的胚系突变，而NLRP1是人类皮肤炎症小体最重要的传感器。

NLRP1上有17个外显子，PYD结构域位于1号外显子，LRR结构域位于5号外显子。1号外显子可出现NLPR1的胚系错义突变，5号外显子可出现移码突变（A）。作者将各种哺乳动物PYD结构域做了一个测序，发现了序列中常出现的几个错义突变，包括A54T、A66V和M77T（B）。

与此同时，作者也比较了皮肤、骨髓、脾脏中各个炎性小体传感器的转录水平，发现皮肤中仅NLRP1高度表达，而骨髓中NLRP1和NLRP3均高表达，脾脏中虽然NLPR1高表达，但其他传感器也是表达的（C）。在健康人的原代细胞中，比较了纤维母细胞、黑色素细胞、角化细胞和外周血单个核细胞（PBMCs）中已知炎症小体传感器基因的表达水平以及炎症小体效应器和基质中各蛋白表达情况，可看到炎症小体传感器仅NLRP1在纤维母细胞、角化细胞和外周血单个核细胞中均表达，而其他传感器均不表达；角化细胞中可出现所有炎性小体效应器和基质的表达（D）。（KRT14为角化细胞特异标记物，因而在PBMCs中不表达。）

为了很清楚地看懂图E，我们可以先了解一下RNAscope的技术原理。1）对石蜡组织切片或者细胞爬片进行预处理，以增加通透性；2）目的RNA与特性的双“Z”探针进行杂交，目的探针是寡聚核苷酸探针，在探针的一端有与预放大系统结合的位点；3）预放大系统与目的探针杂交，放大系统与预放大系统杂交，最后标签探针与放大系统特异性杂交，在标签探针的一端是显色或者荧光基团；4）在明场或者荧光显微镜下观察显色样品。因而我们可以很清晰地看到有毛发的皮肤上NLRP1mRNA的存在（dapB为RNAscope原位杂交的阴性对照）。同时通过免疫组化染色也可以发现了有毛发和没有毛发的皮肤上均有NLRP1蛋白的表达。

三、那么NLRP1突变是如何导致MSPC和FKLC疾病的呢？通过Figure3可看到作者发现了NLRP1的突变可引起炎性小体的激活。

让我们一起来看看作者是如何进行实验的呢？在介绍之前，先给大家大致说明一下炎症小体，炎症小体是一个由CASP1、ASC（PYCARD）、NALP等组成的多蛋白寡聚体。我们可看到NLRP1的突变可引起炎症小体组成部分—ASC颗粒的增多（A）。同时NLRP1的突变增加了ASC颗粒的寡聚化（B）。紧接着作者挑取了16个NLRP1的SNPs（在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性），定量比较了含有ASC颗粒的细胞数量，发现细胞数量均较低，与野生型和空白对照一样，均在20％以下，ASC颗粒含量较高的只有A54T、M77T、A66V、F_Rdel这四个突变方式，证明了造成MSPC、FKLC患者中这些突变的稀有性（C）。除了ASC这一炎症小体组成部分的增多之外，作者还发现了NLRP1的突变同时可以激活caspase1，从而促进IL-1β前体的剪切和成熟IL-1β的分泌（D）。

作者在永生化的角化细胞中，同样发现了caspase1的激活，IL-1β前体的剪切和成熟型IL-1β的分泌，证明了炎性小体的激活这一过程存在于角化细胞中（E）。将角化细胞中ASC颗粒干扰后，IL-1β的分泌减少，再次说明ASC存在于角化细胞中，而细胞因子的释放需要炎性小体的激活（F）。

四、作者开始探究NLRP1基因上的哪个部位可引起炎症小体的激活。通过Figure4可看到作者发现NLRP1的PYD结构域是自我抑制区，而NLRP1的突变导致该抑制无效，并且干扰其折叠，从而激活炎症小体。

作者测序比较了人类所有的PYD结构域，发现NLRP1的PYD结构域有其自身的分支。红色代表了NLRP1的PYD结构域，而蓝色则为其他的炎性小体传感器的PYD结构域。与其他的炎性小体传感器相比，NLRP1是唯一一个包含PYD和CARD结构域的基因（A）。所有在MSPC患者中突变的碱基如A54，A66和M77在其他NLRs中是保守的（B）。

为了进一步探究A54，A66和M77这些突变是如何引起炎性小体激活的，作者猜想这些突变是否可以直接促进ASC颗粒的增加。用mCherry标记的NLRP1、NLRP3和AIMPYD构建体转染T-ASC-GFP细胞，发现在NLRP3和AIM2的PYD中有粗大的ASC颗粒，而野生型和突变型的NLRP1中没有ASC颗粒，因此NLRP1PYD不可能直接促进ASC颗粒的增加（C）。

之后作者对NLRP1进行了一个剪切。将野生型NLRP1分成整条基因，N端缺失的第93个氨基酸至第个氨基酸，PYD结构域缺失的第个氨基酸至第个氨基酸三个部分，将M77T突变的NLRP1基因分成整条基因，CARD结构域缺失的第1个氨基酸至第个氨基酸和仅PYD结构域三个部分。作者发现野生型NLRP1N端缺失的第93个氨基酸至第个氨基酸，PYD结构域缺失的第个氨基酸至第个氨基酸和NLRP1M77T突变型的整条基因这三个部分所含ASC颗粒细胞数量较之其他三部分多，同时IL-1β的分泌量也增加。由此作者得知未突变的PYD结构域可使NLRP1维持在一个自动抑制、无活性的状态，而突变的PYD结构域可促进ASC低聚化的形成。除此以外，有图还能得知C末端至自发蛋白水解区这个部分对ASC颗粒的增加和炎症小体信号通路的形成是必要的（D、E、F）。

再次证明了第个氨基酸至C末端对ASC颗粒过表达的必要性（G）。作者通过观察NLRP1和NLRP3的结构，可发现A54，M77，A66突变都位于中心螺旋（α4，5）的疏水区域，这三个位置的突变会破坏NLRP1的PYD结构域（H）。通过二维核磁共振，可看到左图纳米化学位移光谱的分散性好，证明这是天然折叠蛋白。而中间和右图为无规卷曲，证明A54T和A66V在溶解状态中是错误折叠或未折叠的，再次证明了NLRP1突变会干扰PYD结构域的天然折叠（I）。（红色箭头代表天然折叠PYD结构域的NMR信号特点，可见天然折叠的PYD结构域分布在蓝色区域两测，蓝色区域代表了无规卷曲化学移动区域。）

五、已经发现了PYD结构域可以起到自我抑制作用，那么可以猜想PYD结构域是否会对NLRP1的结构产生影响从而引起炎性小体的激活？通过Figure5可看到，的确，PYD和LRR结构域抑制了NLRP1的自发寡聚化。

野生型NLRP1分子是单体形式，而突变使得单体转变为高分子量的寡聚物（A）。这些结果提示PYD和LRR结构域对于维持NLRP1分子的单体性是必要的，并且能防止其自发寡聚化。CARD结构域缺失会显著降低寡聚物形成，而CARD结构域则会促进寡聚物的形成（B）。在NLRP1发生突变的基础上，再增加蛋白酶切位点的突变（FA），这会使NLRP1寡聚化逆转，甚至引起NLRP1单体的再次出现（C），同时也能使含ASC颗粒的细胞数量减少（D）和成熟IL-1β分泌减少（E）。

这幅图画的非常漂亮，作者向我们介绍了NLRP1激活的一个模型。野生型的NLRP1以非活性的单体形式存在。当NLRP1的PYD、LRR结构域发生突变时，NLRP1可与一个假定的配体快速结合引起NLRP1的自我寡聚化。这种自我寡聚化依赖于FIIND结构域的自发蛋白酶解。而蛋白酶切位点至C末端这一部分可促进ASC颗粒的结合并触发炎性小体的激活。

六、炎性小体激活了，那么它又是如何引起那些临床现象的呢？通过Figure6可知道NLRP1突变通过旁分泌IL-1信号通路引起炎性细胞因子的释放和表皮畸形增生。

NLRP1突变在永生角化细胞中过度表达（A）。（Doxycycline用于培养细胞中目的基因的诱导表达）在NLRP1突变时IL-1α、IL-1β、IL-18释放增加，但在特异性caspase1抑制剂Z-WEVD-FMK的作用下，这些物质的释放被阻断（B）。

作者接下来使用下一代RNA测序来分析NLRP1突变对角化细胞基因表达的影响，通过基因集富集分析（GSEA）可看到IL-1/NFkB信号通路基因在上调的转录本中显著富集，这说明IL-1/NFkB活化可能是MSPC和FKLC患者皮肤出现症状的驱动因子（C）。然后作者对上调的转录本进行更仔细的检查，发现与先前公开在原代角化细胞中重组IL-1α诱导型基因的数据集显著重叠。这些上调的转录本包括应激反应性分泌因子，已知的促炎细胞因子以及角化细胞分化标记物（D）。在一个3D皮肤器官型培养中，用IL-1a，IL-1b和IL-18处理后，可看到基底层表皮厚度增加，上基底层Ki67阳性细胞显着增加（E、F）。（Ki67是一种增殖细胞相关的核抗原，作为标记细胞增殖状态的抗原）。

七、做了那么多细胞系实验，怎么能不取患者原代细胞再次验证呢？作者在MSPC和FKLC患者的角质细胞中同样发现了特异性炎性小体的激活（Figure7）。

作者使用Luminex平台比较了患者和健康者原代角化细胞的细胞因子和趋化因子谱，发现患者的炎症小体依赖性细胞因子IL-1b位于顶部，而TNFα，IL-1RA，IL-1a，TGFα和GM-CSF也均上调（A）。之后作者使用定量ELISA证实了IL-1b，IL-18和IL-1α分泌的显著增加（B）。这些结果均表明MSPC和FKLC患者的角化细胞倾向于自发性炎症小体激活和细胞因子释放。之后作者还在患者的角化细胞中同样发现ASC寡聚体的形成（C）。同时在A66V突变的患者血清中发现IL-1b水平的增加，但是在F_Rdel突变的患者血清中IL-1b水平却并未增加（D）。作者推断F_Rdel突变可能仅在杂合状态引起轻度炎症小体激活。最后，作者对MSPC患者做了实时皮肤损伤活检，进一步证明MSPC患者的皮肤损伤是由于NLRP1炎症小体激活后而未做处理的、慢性的炎症反应（E）。（SA8andSA9为炎症小体的标记物）

作者认为，未作处理的角化细胞驱动的炎症是MSPC和FKLC的病理学基础。这两种疾病中的特征性的、反复发作的局灶性损伤可能起源于角化细胞中NLRP1突变，引起炎症小体的异常活化。随后IL-1细胞因子的快速局部释放可能引发相邻角化细胞和成纤维细胞的旁分泌信号网络，导致次级炎症细胞因子和生长因子例如TNFα和KGF的分泌。这种异常的“伤口愈合”样响应导致表皮增生和角化棘皮瘤形成，多年来持续未作处理的炎症可以促进额外的获得性致癌突变并促进向鳞状细胞癌发展的恶性转化（F）。

文章思路：

文章讲到这里就结束了，作者的研究建立起了异常炎症小体激活和遗传性炎症及增殖性皮肤病之间的桥梁，这提高了炎症小体调节用于临床上以改善慢性皮肤炎症性疾病和降低上皮皮肤肿瘤风险的可能性。此外，FKLC的表型与几种常见的皮肤病学疾病如毛囊角化病和扁平苔藓显着重叠，其机械的见解目前缺乏。因此，该研究结果将为今后的工作铺平道路，揭示NLRP1炎症小体在其他人类疾病状态，包括炎症和自身免疫性皮肤疾病以及皮肤癌中的作用。